社会上儒家、佛家等仇视天主教的也群起附和。于是，1664年辅政大臣下令逮捕汤若望，当时汤若望已73岁高龄，又患中风，四肢瘫痪，口齿不清，受审时只好由其助手南怀仁代为申辩。一时冤狱大兴，南怀仁、利类思、安文思及各省宣教士纷纷被捕。当年秋、冬，吏部、礼部进行调查审讯，清廷也派人到广东查核，并未查实。但结果仍是杨光先胜诉，将汤若望判处凌迟，其他人分别斩首流徒。恰逢北京发生强烈地震，京师人心恐慌，以为狱讼不公，天象示警。康熙帝的祖母孝庄文太皇太后出面干预，辅政大臣将汤若望案件奏请太皇太后定夺，太皇太后阅奏后大为不悦，将奏折扔在地上。斥责辅政大臣，下令释放。宣教士们幸免于难，但支持新历的5名中国官员（均为天主教徒）仍被处决，一些信教官员被革职。
恶意排斥西法的杨光先虽然取得了胜利，但他接任钦天监正，实在是用人不当，因为他的历算知识甚为有限，监内工作一片混乱，屡次错测节气时日，错报日月食的时间。所用《大统历》、《回回历》都是过时历法，须作根本改订。杨光先自知力难胜任，再三要求辞职，但未获准许。
1668年，14岁的康熙帝与鳌拜的矛盾日益尖锐，在历法这一敏感问题上首先表现出来。当时钦天监的错误已闹得满城风雨，而鳌拜仍极力回护。康熙召集杨光先、南怀仁一起讨论天文历法。命大学士和他们一起到观象台，预推正午日影所止之处，经过3天实地测验，南怀仁推测无误，杨光先等都有误差。康熙命南怀仁审查杨光先所订历书，结果错误百出。为了进一步验证，康熙又安排了立春、雨水两个节气以及月亮、火星、木星运行的五项测验，令大臣们共同观察，结果南怀仁所言逐款皆符，而杨光先逐款不合。西洋历法以实际测算的准确性取得胜利，杨光先被革职，他还喋喋不休地抗辩，被康熙斥骂了一顿，逐回原籍，中途病死。1669年康熙亲政，为汤若望平反，亲撰祭文并参加葬礼。
历法之争最后告终，南怀仁接任钦天监正，此后，许多宣教士在他的推荐下来到北京，在清廷供职。他们有的从事天文历法，改造北京观象台，制作天文仪器；有的出入宫廷，充当皇家教师，给康熙讲授数学、天文、物理知识；有的从事音乐、绘画、雕刻；有的在造办处，指导工人制作自鸣钟和其它机械；还有的协助清政府制作全国地图，在各省实地测绘，准确地完成了著名的《皇舆全览图》。
随着汤若望冤狱的兴起，全国范围内展开针对宣教士的大搜捕，信徒的宗教活动
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