州（今贵州省遵义市）作乱，秦良玉的丈夫石柱宣抚使马千乘率领三千人随李化龙前往征讨，秦良玉率领五百精兵押运粮草，与副将周国柱扼守邓坎（今贵州凤冈县南）。
万历二十八年（1600年），杨应龙军趁李化龙大军在营中大摆筵席发动袭击，秦良玉与丈夫当先将其击败，而后乘胜追击，接连攻破金筑关等七个营寨。而后又协助酉阳各路官军攻取桑木关，大破杨应龙军，秦良玉为南川路战功第一，但杨应龙兵败身死之后，秦良玉却不自报军功。
万历四十一年（1613年），马千乘被太监邱乘云诬告，病死于云阳的监狱之中。秦良玉于是代领丈夫马千乘的职位。
泰昌元年（1620年），后金入侵辽东，朝廷诏令秦良玉出兵援助。秦良玉派兄长秦邦屏，弟弟秦民屏率领几千人先前往。朝廷赐秦良玉三品官员的服饰，并任命秦邦屏为都司佥书，秦民屏为守备。
天启元年（1621年），后金包围重镇沈阳，秦邦屏、秦民屏随总兵童仲揆渡浑河与清军血战，秦邦屏战死沙场，秦民屏突围而出。秦良玉于是亲率三千人前往直抵榆关（今河北山海关），所经过的地方秋毫无犯。明熹宗下诏给秦良玉加二品官员服饰，并封秦良玉为诰命夫人，封秦良玉儿子马祥麟为指挥使。秦良玉上言秦邦屏的死状，请求从优抚恤，兵部尚书张鹤鸣进言浑河血战斩获敌人首级数千，实际上是石柱、酉阳两地土司的功劳，建议朱由校厚待秦良玉家的家人。朱由校于是下令赠秦邦屏都督佥事，子孙世袭，并且与陈策等人一同立祠祭祀，秦民屏官进都司佥书。
崇祯三年（1630年），清军大举进攻，永平四城失守，皇太极进围京都。秦良玉率秦翼明奉诏勤王，并拿出家中的资产充作军饷。皇帝朱由检特意下诏表扬，并于平台召见秦良玉，赏赐秦良玉钱币牲畜酒水等，并赋诗四首表彰秦良玉的功劳。皇太极退兵后，秦良玉率兵回乡，而秦翼明就在京畿附近驻扎。绝世唐门 fo
崇祯七年（1634年），张献忠攻陷川东重镇夔州（今重庆奉节），秦良玉率军赶到，张献忠不战而走。秦良玉率军追击，与正好回川的儿子马祥麟前后夹击，打败张献忠，使之退走湖广。而后张献忠受朝廷招安。
崇祯十三年（1640年），张献忠联合罗汝才再次造反，罗汝才率兵攻打夔州。秦良玉率军前往，罗汝才不战而走，秦良玉追至马家寨，大破罗汝才，斩首六百级，秦良玉又率军追击，先后在留马垭、谭家坪北山、仙寺岭大破敌兵，将其首领东山
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